KULTUR PROTOPLAS / FUSI PROTOPLAS

KULTUR PROTOPLAS / FUSI PROTOPLAS

Download File

 KULTUR PROTOPLAS / FUSI PROTOPLAS.docx

keyword :

 kultur protoplas fusi protoplas p rotoplas adalah sel tumbuhan yang telah dikupas bagian dinding selnya atau sel tumbuhan telanjang tanpa dibungkus oleh dinding sel fusi protoplas adalah salah satu metode persilangan atau hibridisasi spesies dengan memanfaatkan rekayasa genetika konvensional teknik fusi protoplas dapat digunakan untuk mencampur sifat genetik dari spesies yang sama ataupun dari spesies yang berbeda selain itu teknik ini menguntungkan untuk diterapkan dalam persilangan tanaman steril ataupun tanaman dengan siklus hidup yang panjang untuk menginduksi atau mendukung terjadinya fusi protoplas dapat dilakukan dengan pemakaian senyawa kimia seperti polietilen glikol peg ataupun penggunaan arus listrik untuk membantu fusi elektrofusi ketika dua protoplas bersatu dapat terjadi pemisahan atau penggabungan dua inti sel nukleus sehingga menghasilkan tanaman dengan sifat baru hasil pencampuran kedua tetua apabila salah satu inti sel hilang selama terjadinya fusi maka akan dihasilkan sel baru yang disebut sitoplasmik hibrid cybrid kultur ptotoplasma dilakukan melalui secara bertahap mulai dari persiapan eksplan dan isolasi protoplasma diikuti dengan penanaman mutasi protoplasma dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa mutagen ke dalam media tanam atau dengan memperlakukan protoplasma dengan senyawa mutagen tersebut silangan somatik dilakukan dengan cara penggabungan dua buah protoplama segera setelah isolasi kemudian ditumbuhkan prosedur kultur protoplasma secara umum adalah sebagai berikut persiapan eksplan eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya kembali kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik .jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplasma ini beragam umumnya jaringan yang lebih muda dan berasal dari tanaman yang mempunyai umur fisiologis muda seperti pucuk muda seperti dari kecambah bibit plantlet pucuk adventif hasil pangkasan protoplasma dari sel jaringan tersebut lebih mudah diisolasi protoplasmanya karena dinding selnya masih sederhana dan hanya terdiri dari dinding sel primer saja dan jaringannya masih memiliki sel- sel parenkim dindingnya belum berlignin selain itu ada juga yang menggunakan jaringan yang telah dewasa namun media untuk isolasi protoplasma dari jaringan ini lebih kompleks karena dinding selnya telah berlignin telah memiliki dinding sel primer dan dinding sel sekunder sterilsasi eksplan bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu dicuci kemudian disterilkan umumnya menggunakan sodium hypoklorit 1 – 2 selama 10 – 30 menit tergantung jenis eksplan yang digunakan eksplan tersebut selanjutnya dicuci dengan air steril 3 – 4 kali untuk mencuci sisa sodium hipoklorit pada eksplan page 2 of 12 isolasi protoplasma isolasi protoplasma dapat dilakukan dengan dua cara 1 metode mekanikal isolasi protoplasma menggunakan metode ini dikenalkan pertama kali oleh klercker pada tahun 1892 isolasi protoplasma dilakukan dengan cara mengupas dinding sel menggunakan alat bedah mikro metode ini telah berhasil mengisolasi protoplasma dari daun saintpaulia ionantha dan dikulturkan hingga tumbuh kalus kelebihan dari metode ini adalah bila sel yang digunakan mempunyai vakuola sel yang relatif besar sedangkan kelemahannya adalah 1 keberhasilannya rendah 2 pekerjaan yang membutuhkan tenaga banyak dan membosankan 3 viabilitas protoplasma rendah karena sering terjadi kerusakan protoplasma selama proses pengupasan dinding sel 2 metode enzimatik isolasi protoplasma dilakukan dengan menggunakan enzym yang dapat menghancurkan dinding sel enzym yang digunakan bervariasi jenis dan konsentrasinya tergantung kondisi fisologis eksplan terutama umur jaringan yang erat kaitannya dengan komposisi dinding selnya enzym yang digunakan untuk mengancurkan dinding sel tumbuhan umumnya ada 3 yaitu cellulase untuk menghancurkan sellulose hemicellulase untuk menghancurkan hemisellulose pectinase untuk menghancurkan pektin alat-alat yang digunakan untuk isolasi dan kultur ptotoplasma adalah sebagai berikut laminar air flow cabinet centrifuge inverted microscope gyratory shaker magnetic stirrer hot plate ph meter saringan stainless stell lubang 60 – 70 m bacterial filter nalgene filter unit 0 22 m millex filter unit 0 45 m spet dan jarum piset dg ujung runcing pisau kultur pipet 5 ml berujung lebar pipet pastur 2 ml petri dish gelas beker parafilm plastic wrapp bahan- bahan yang digunakan untuk isolasi protoplasma adalah sebagai berikut  eksplan protoplasma yang telah berhasil diisolasi berasal dari organ-organ seperti daun tangkai daun pucuk akar buah koleoptil embrio dan mikrospora diantara organ tersebut sel yang paling mudah dan bagus untuk diisolasi protoplasmanya adalah berasal dari jaringan mesofil daun karena bentuk selnya relatif seragam tidak perlu membunuh tanamannya dinding sel mudah terkelupas oleh enzim  ethanol 70  larutan isolasi protoplasma page 3 of 12 tahapan pengerjaan protoplasma a jaringan tanaman seperti daun tembakau disterilkan terlebih dahulu dengan cara merendamnya dalam alkohol 70 selama 30 detik selanjutnya di rendam kedalam larutan pemutih misalnya bayklin 20 yang ditambah beberapa tetes tween selama 15 menit selanjutnya daun tembakau tersebut dibilas menggunakan aquadest steril sebanyak tiga kali jaringan tanaman steril diiris halus dan dikupas eidermis serta dihilangkan urat daunnya dengan menggunakan mata skalpel runcing steril untuk lebih memudahkan isolasi protoplasmanya contoh campuran dan konsentrasi enzym yang digunakan untuk isolasi protoplasma beragam dan tergantung dari jenis jaringan yang digunakan sebagai eksplan seperti 1 medium enzim untuk jaringan akar 2 rhozyme 2 meicellase 0 03 macerozyme r10 2 medium enzim untuk daun serealia 2 cellulysin 0 2 macerozyme r10 0 5 hemicellullase 11 mannitol 3 medium enzim untuk daun tembakau 0 5 onozuka r10 cellulase 0 1 onozuka r10 macerozyme r10 13 0 mannitol ph 5 8 untuk mengurangi daya tarik menarik adhesi antara sitoplasma dengan dinding selnya larutan enzim biasanya ditambahkan senyawa osmoticum senyawa osmoticum yang dapat digunakan antara lain mannitol sorbitol glukosa fruktosa galaktosa sukrosa setelah dinding sel lepas selanjutnya eksplan direndam ke dalam 20 ml larutan media preplasmolisis selama 1-8 jam medium preplasmolisis untuk setiap jenis eksplan berbeda untuk tembakau medium preplasmolisis tersusun atas medium isolasi protoplasma ditambah 13 mannitol komponen medium isolasi protoplasma mip adalah sebagai berikut cacl2 .h2 o 1480 0 mg l kh2 po4 27 2 mgl kno3 101 0 mg l mgso4 .7h2 o 246 0 mg l cuso4 .5h2 o 0 025 mg l ki 0 16 mg l ph 5 8 eksplan dipindah larutan medium enzim komposisi media ini juga berbeda-beda untuk setiap jenis eksplan yang digunakan untuk daun tembakau komponennya dapat dilihat di atas eksplan dipindah ke tabung steril dan dituangi medium enzim sebanyak 10 ml lalu tabung ditutup dengan aluminium foil steril dan diisolasi menggunakan parafilm atau plastik page 4 of 12 wrap tabung berisi eksplan tersebut digoyang pada shaker dengan kecepatan 40 rpm selama semalam atau 4-16 jam pemurnian protoplasma  protoplasma dalam poin 5 disaring dengan filter steril mess 63 µm masukkan ke dalam gelas piala volume 250 ml menggunakan pipet pastuer  medium pencuci mip ditambah 10 sebanyak 3 ml ditambahkan ke dalam cawan petri yang berisi debris dari daun digoyang perlahan dan kombinasikan dengan protoplas campuran enzim dalam gelas piala vol 250 ml  protoplas yang diperoleh dicuci dengan medium pencuci dan saring protoplas yang masih tercampur dengan larutan enzim disentrifuge dengan kecepatan 50 x g selama 10 menit  pelet diresuspensi dalam medium pengapung medium flotasi 10 ml ditambah medium pencuci 1ml selanjutnya disentrifuge protoplasma akan melayang-layang diantara medium flotasi mip 20 dan medium pencuci  protoplasma yang melayang-layang dipindahkan ke dalam tabung ditambah 10 ml medium pencuci selanjutnya disentrifuge maka protoplasma akan mengendap sebagai pelet  supernatan dibuang dan pelet ditambah 10 ml medium pencuci dan diputar lagi  supernatan dibuang sisakan suspensi protoplasma sebanyak 1 ml kerapatan suspensi protoplasma yang dikulturkan untuk setiap spesies tanaman berbeda-beda seperti tembakau suspensi protoplas kerapatannya 50.000 sel ml dan 25000 sel ml untuk protoplasma petunia protoplasma tersebut dikulturkan dalam cawan petri steril media yang digunakan untuk kultur protoplasma dapat berupa media media cair yang diletakkan dalam cawan petri kecil atau media padat media padat dengan pemadat agarose media yang digunakan untuk kultur protoplasma jauh lebih kompleks dibandingkan dengan media untuk teknik kultur lainnya karena protoplasma belum memiliki dinding sel sehingga perlu ditanam pada media awal yang diperkaya dengan osmotikum misalnya sorbitol atau mannitol untuk menghindari plasmolisis penanaman protoplasma ke dalam media dilakukan dengan cara mencampur protoplasma dengan larutan agarose campuran disedot dengan pipet pasteur steril kemudian diteteskan pada cawan petri steril 5 – 10 tetes per petri cawan petri ditutup dengan parafilm selanjutnya kultur diletakkan pada ruang kultur dengan suhu 25 c dan diberikan 16 jam penyinaran setiap 2 minggu ditambahkan media baru ke bagian tetesan protoplasma tersebut teknik kultur protoplasma protoplasma yang telah dimurnikan biasanya dikulturkan dengan dalam medium agar semisolid dan liquid protoplasma sering dikulturkan dalam media liquid untuk meregenerasi dinding sel terlebih dahulu sebelum dikulturkan ke media agar media semisolid agar agar yang digunakan untuk kultur protoplasma adalah khusus yaitu gel agar lunak salah satunya agarose teknik media liquid biasanya digunakan pada fase awal kultur karena mudah larut dan diserap beberapa spesies protoplasmanya tidak dapat membelah dalam media agar tekanan osmotik media direduksi secara efektif kerapatan sel-sel dapat direduksi setelah beberapa hari dikulturkan kelemahan dari teknik ini tidak boleh diisolasi page 5 of 12 dari turunan koloni tunggal yang berasal dari sel induk satu teknik media liquid dapat dibedakan menjadi dua metode 1 metode liquid tetes dengan menggunakan pipet ukuran 100-200 µl suspensi protoplasma dalam media diteteskan pada cawan petri ukuran 60mx15m sebanyak 5-7 tetes cawan petri ditutup dan direkatkan dengan parafilm atau plastik wrap selanjutnya diinkubasikan setiap 5-7 hari tambahkan medium segar baru dengan cara meneteskan langsung pada tetesan suspensi protoplasma yang telah mengalami pertumbuhan metode ini biasanya baik untuk keperluan pengamatan dengan mikroskop kelemahan dari metode ini adalah tetesan-tetesan suspensi menyatu menjadi satu tetesan di pusat 2 metode tetes menggantung dengan menggunakan pipet volume 40-100 µl suspensi protoplasma diteteskan di dalam tutup cawan petri selanjutnya cawan petri ditutup dengan menggunakan tutup yang telah ditetesi suspensi protoplasma sehingga tetesan suspensi tersebut akan menggantung di dalam tutup cawan petri tersebut proses yang terjadi setelah kultur protoplas dilakukan 1 fusi protoplas peleburan protoplasma dari 2 genom yang berbeda dapat diperoleh baik secara spontan ataupun dengan teknik pemacuan peleburan a metode peleburan spontan peleburan protoplasma secara spontan biasanya terjadi karena membran protoplas yang sangat tipis dan lunak sehingga mudah sobek atau pecah yang dapat mengakibatkan peleburan protoplasma biasanya terjadi pada protoplasma yang diisolasi dari kalus perleburan protoplasma dengan teknik ini biasanya terjadi pada protoplasma yang mempunyai asal tanaman yang sama sehingga tidak bernilai untuk perbaikan tanaman b metode pemacuan peleburan untuk mencapai peleburan protoplasma diperlukan adanya agensia untuk memacu terjadinya peleburan protoplasma dikenal sebagai fusagen yang berbeda jenis tanamannya larutan fusagen contohnya perlakuan dengan sodium nitrat 5 5 sodium nitrat dalam larutan 10 sukrose dan kultur diinkubasikan dalam water bath bersuhu 350 c selama 5 menit selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 200 g selama 5 menit subernatan dibuang dan pelet disimpan dalam water bath bersuhu 350 c selama 30 menit pada beberapa saat protoplasma akan terjadi peleburan agregat ditiangkan secara hati-hati pada medium kultur yang telah ditambah 0 1 nano teknik ini akan dihasilkan dengan frekuensi rendah bila asal protoplasmanya dari mesofil daun perlakuan ion calsium padas ph tinggi teknik ini telah digunakan pada protoplasma tembakau caranya protoplasma yang telah diisolasi ditambahkan larutan fusagen berupa 0 5 page 6 of 12 m mannitol yang berisi 0 05 m cacl2 .2h2 o pada ph 10 5 selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 50 g selama 3 menit selanjutnya tabung sentrifuge disimpan dalam water bath bersuhu 370 c selama 40-50 menit hingga protoplasma melebur perlakuan polyethelene glycol peg dari sekian banyak metode peleburan protoplasma metode ini yang yang berhasil dengan baik untuk melebur protoplasma suspensi protoplasma dilarutkan dalam larutan peg 1 ml suspensi protoplasma dalam medium kultur dicampur dengan 1 ml 28-56 peg 1500-6000 mw tabung digoyang selama 5 detik dan biarkan berhenti 10 menit selanjutnya suspensi protoplasma tersebut dipindahkan dari larutan peg dengan cara mencucinya menggunakan medium kultur sebanyak 2 kali hasil peleburan protoplasma ini berupa pembentukan heterokarion dengan frekuensi yang tinggi sedangkan kebanyakan tipe sel sitoplasmik dengan pembentukan hetekarion binukleat rendah 2 pembentukan dinding sel perkembangan protoplasma diawali dengan regenerasi atau terbentuknya dinding sel diikuti terbentuknya koloni sel menyerupai kalus pada beberapa spesies protoplasma membentuk kalus dan beregenerasi melalui organogenesis atau embryogenesis 3 regenerasi protoplasma regenerasi protoplasma membentuk koloni sel kemudian tanaman lebih sulit dibandingkan dengan teknik kultur jaringan jaringan lain salah satu teknik yang digunakan untuk merangsang regenerasinya adalah menggunakan sel-sel lain sebagai perawat sehingga tekniknya disebut teknik nurse culture untuk kultur satu protoplasma nurse cells diletakkan berdekatan dengan kultur protoplasmanya untuk mendukung pertumbuhan dan perkembangan protoplasma teknik ini pertama kali diperkenalkan oleh muir dkk tanaman yg dihasilkan dari kultur protoplasma bisa seragam atau bervariasi disebut protoclonal variation apabila dalam penanaman protoplasma ditambahkan mutagen ke dalam media maka hasil regenerasi akan berupa generasi baru produksi tunas dapat dilakukan pada media cair umumnya ke dalam media ditambahkan hormon pertumbuhan sitokinin misalnya 0 5 m bap setelah tunas terbentuk cukup besar tunas selanjutnya dalat diakarkan salah satu contoh media pengakatran protoplasma adalah 1 2 ms 3-aminopyridine untuk tembakau atau picloran untuk tebu plantlet yang cukup besar selanjutnya diaklimatisai kemudian ditanam di lapangan perlakuan peleburan elektro elektrofusion protoplasma diletakkan di dalam sel kultur yang kecil dan berisi elektrode yang berbeda potensialnya protoplasma diletakkan diantara barisan elektrode-elektrode selanjutnya protoplasma diberi shok gelombang pendek elektrik yang akan mengiduksi terjadinya peleburan protoplasma dalam metode ini ada dua tahapan prosedur yang dimulai dengan penggunaan ac dari intensitas rendah untuk suspensi protoplasma kolektor dielektroforetik diatur 1 5 v dan 1 mhz dan konduktivitas elektirk dari medium suspensi kurang dari 10-5 detik cm efek sebuah elektroforesis dijalankan akan membuat masing-masing sel berbenturan sepanjang alur barisan elektrode tahap kedua injeksi aliran listrik dc dengan intensitas tinggi 750- 1000v cm dengan waktu yang sangat singkat yaitu 20-50 µdetik menyebabkan membran page 7 of 12 protoplasma robek dan akan menghasilkan peleburan yang selanjutnya membran akan mengalami reorganisasi teknik fusielektro sangat sederhana cepat dan efisien sel-sel yang telah di fusikan secara eletronik tidak menunjukkan respon yang sitotoxit namun metode ini jarang digunakan fusi protoplas dari daun petunia sp dan kelopak bunga impatiens neuguinea yang berwarna merah page 8 of 12 protoplas sel daun petunia sp dengan perlakuan enzim selulase dan pektinase page 9 of 12 page 10 of 12 fig 1 in vitro cultured plantlets of solanum genus for protoplast isolation page 11 of 12 page 12 of 12 1 of 12 kultur protoplas.docx